Революционизация редактирования генов: достижения технологии CRISPR/Cas в биомедицинских приложениях

Технология CRISPR/Cas, первоначально обнаруженная как адаптивная иммунная система у прокариот для распознавания и разрезания вторгающихся нуклеиновых кислот, превратилась в мощный инструмент для редактирования генов в клетках млекопитающих. Белок SpCas9, полученный из Streptococcus pyogenesCas-белок — первый белок, перепрофилированный для редактирования генома, использующий синтетическую направляющую РНК (sgRNA) для нацеливания на определенные нуклеотидные последовательности в геноме.

sgRNA включает в себя последовательность-основу, необходимую для связывания Cas9, и настраиваемый 20-нуклеотидный спейсер, определяющий геномную мишень. Для эффективного образования двуцепочечных разрывов (DSB) последовательность спейсера должна соответствовать двум критериям: она не должна комплементарно связываться с другой геномной ДНК и должна быть примыкать к последовательности протоспейсерного смежного мотива (PAM), которая необходима для связывания Cas9.

Двойная активность Cas9 по расщеплению ДНК основана на наличии двух активных центров, RuvC и HNH, что позволяет точно формировать двухцепочечные разрывы ДНК. Исследователи разработали множество приложений с использованием системы CRISPR/Cas, в том числе:

1. Скрининг с использованием нокаута всего генома: Создав обширную библиотеку sgRNA и применив селективное давление, исследователи могут идентифицировать гены, необходимые для выживания клеток в различных условиях.

2. Активация и подавление генов: Используя dCas9, который не обладает нуклеазной активностью, исследователи могут регулировать экспрессию генов, объединяя dCas9 с активаторами или репрессорами транскрипции, что позволяет детально изучать функции генов.

3. Эпигенетическое редактирование: dCas9 можно модифицировать для изменения ДНК или гистонов, что позволяет проводить целенаправленные эпигенетические изменения, способные усиливать или подавлять экспрессию генов.

4. Визуализация хроматина: Благодаря объединению dCas9 с флуоресцентными белками ученые могут визуализировать определенные участки генома в живых клетках, что расширяет наше понимание динамики хроматина.

5. Идентификация белков, связывающих ДНК/РНК: Сочетание системы CRISPR/Cas с технологиями мечения по близости позволяет идентифицировать белки, взаимодействующие с конкретными геномными областями.

6. Молекулярная эволюция: Система позволяет вносить мутации в целевые последовательности ДНК, что облегчает изучение функций генов в условиях селективного давления.

7. Вставка, опосредованная транспозонами: Сочетая белки Cas с транспозазами, исследователи могут добиться эффективной интеграции экзогенной ДНК в геном.

8. Удаление крупных фрагментов: Система CRISPR-Cas3 позволяет удалять большие последовательности ДНК, открывая новые терапевтические возможности для лечения вирусных инфекций.

9. Хранение данных в памяти: Самонаводящиеся направляющие РНК (gRNA) могут создавать постоянные мутации, которые служат биологическими маркерами для конкретных событий, открывая путь для более точного отслеживания клеточных реакций.

10. Выявление вирусов: Системы CRISPR/Cas успешно применяются для быстрого обнаружения вирусов, включая ВИЧ и SARS-CoV-2, что расширяет возможности диагностики.

11. Инновации в генной терапии: Внедрение первого препарата для редактирования генов на основе CRISPR/Cas9, CASGEVY™, представляет собой важную веху в лечении серповидноклеточной анемии (СКА) и трансфузионно-зависимой β-талассемии (ТДТ). Этот препарат, одобренный в нескольких регионах, подчеркивает потенциал редактирования генов для преобразования терапевтических подходов.

По мере развития области редактирования генов, сфера применения технологии CRISPR/Cas быстро расширяется. Благодаря значительным государственным инвестициям в биотехнологии и прецизионную медицину, постоянно происходят прорывы в генной терапии различных заболеваний, включая генетические расстройства, рак и другие. Аутоиммунные заболевания.